正文

真核mRNA测序

    真核mRNA转录组测序是借助新一代高通量测序技术,以真核细胞在某一功能状态下所能转录出的全部mRNA为研究对象,全面了解该生物样品在特定时空下基因的表达情况。此技术可用于研究基因表达、cSNP、新转录本、全新异构体、剪接位点、等位基因特异性表达和罕见转录等,在基础研究、分子育种、临床诊断和药物研发等领域已得到广泛应用。 


技术路线

1

 

技术参数

产品

策略

推荐数据量

周期

真核mRNA测序

Hiseq PE150

有参 6G

40

         无参 10G

               50

样品要求

1. RNA:完整且无污染的RNA样品,总RNA ≥ 1 μg (单次200 ng),浓度≥ 50 ng/uLOD260/OD2801.8-2.2之间,OD260/OD2301.8-2.2之间,RIN≥ 728S/18S≥ 1.5。样品切忌反复冻融,用封口膜将样品管密封,防止污染,用干冰运输到实验室。

2. 组织样品:动物、植物、微生物总量大于300 mg的新鲜组织(植物材料应尽量选取幼嫩部位)。采样后将样品立即用TRIZOLRNAlater或液氮速冻,分装保存于-80℃(保存期不超过一个月),封口膜将管口密封,干冰运输至实验室(不超过48 h)

3. 细胞样品:细胞个数≥ 1×107个。先使用TRIZOL试剂进行处理,每0.25 mL样品(5~10×106个细胞)加入0.75 mL TRIZOL试剂(可参考试剂说明书),分装保存于-80℃(保存期不超过一个月),封口膜将管口密封,干冰运输至实验室(不超过48 h)

 

常见问答

1. Q:转录组测序与基因芯片相比有什么优势?

    A:基因芯片是用已知序列的探针和样本mRNA进行杂交来获得mRNA的序列信息,只能检测已知mRNA,无法发现新的mRNA;转录组是直接对样本mRNA进行测序,能够发现新的mRNA。转录组测序对基因表达上调或下调的检测灵敏度高得多。在有参考基因组的基础上,通过转录组测序可进行可变剪切,基因结构变异,全基因组水平基因表达丰度等诸多分析。

2. QRNA降解对mRNA测序有什么影响?

    A:若RNA3’端发生降解,则无法通过3’端的poly(A)捕获mRNA,反转录不能得到全长cDNA;若5’端发生降解,通过3’poly(A)捕获到的mRNA,其测序结果将会出现明显的3’5’偏向性。

3. QRNA起始量不足对测序质量的影响。

    ARNA起始量不足时,需要通过增加PCR循环数以获得足够的量用于后续的测序,引发duplication容易过高导致大量冗余数据产生、PCR扩增偏好性等问题。

4. Q:转录组测序需要多少数据量?
    A:转录组测序所需的数据量依据物种转录组大小的不同而有所差异。针对有参转录组,可通过分析基因组信息,统计编码基因的个数及碱基数评估转录组的大小,同时参阅相关的文献,进而确定具体数据量;针对无参转录组,则参考相近物种的转录组大小以确定数据量。

5. Q:文库准备过程中,反转录引物的选择。

    AcDNA合成过程中,反转录引物有随机引物和oligo d (T)引物。常规情况下,选择随机引物,若有特殊要求,也可以选择 oligo d (T) 引物。 oligo d (T) 引物可以保证扩增产物包含mRNA3’端,同时减少rRNA的影响。但oligo dT引物扩增的片段长度偏短并且扩增产物所包含的信息量偏向3’端。