ChIP-seq

    染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation ChIP)是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具,通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。将ChIP与第二代测序技术相结合的ChIP-seq 技术,以高效率的测序手段得到高通量的数据结果,从而获得在全基因组范围内与特异性修饰组蛋白和转录因子等结合的DNA区段信息。

        ChIP-seq 的原理:染色质免疫共沉淀技术(ChIP)特异性地富集目的蛋白结合的DNA 片段,DNA的纯化与文库构建,DNA文库高通量测序,将数百万条序列标签精确定位到基因组上,获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA 区段信息。

chip-seq

技术路线

技术路线

 

 

技术参数

产品

策略

推荐数据量

周期

ChIP-seq

Hiseq PE150

30M reads

DNA45

细胞:90

 

样品要求

1. 样本类型:ChIPed DNA样品或固定好的细胞样品

2. 样品总量:≥ 10 ng ChIPed DNA;固定细胞数不低于107个(单次2×106个)

3. 样品浓度:≥ 1 ng/ul

4. 样品质量:1.8 ≤ OD260/280 ≤ 2.01.5 ≤ OD260/230DNA片段大小在100-300 bp范围内,主带明显,250 bp左右最佳,同时请提供DNA打断时的检测胶图,样品最好经过ChIP-PCR验证。

5. 送样信息:样品溶于超纯水中,放于DNase-free 1.5 ml 离心管中,管口用封口膜封好。请在样品管上做好清楚的标识,最好写在标签纸上,贴在管壁。仔细填写样品信息表,同时提供质量检测相关数据和图片。

6. 样品运输:DNA样品请用干冰或者冰袋运输。干冰运输时间不要超过72小时;冰袋运输,时间最好不要超过24小时。样品在保存和运输过程中避免反复冻融。

 

常见问答

1. Q:文库制备过程是否需要PCR 扩增?PCR 扩增后是否会影响最后的结果?

    AChIP-seq是基于二代测序平台,在文库制备过程中需要进行PCR扩增,对PCR循环数有严格的控制以减少扩增造成的影响。因此由PCR引起的偏向性非常小。

2. QDNA片段范围的跨度多少,对后续测序有什么影响?

    ADNA片段范围对定量准确性、测序质量与数据产量都可能有影响,而且跨度越大,影响越大。通常我们要求打断后的DNA条带在100-300 bp 之间,主峰250 bp 左右。目前在建库过程中允许的最长跨度为200 bp

3. Q:哪些因素会影响ChIP-seq的结果?

    A:抗体的质量与特异性、实验设计、ChIP 实验过程、DNA片段长度范围、测序深度、测序质量等都会影响ChIP-seq 的结果。

4. QInput 是什么?有什么作用?Input IP 样本之间的关系是什么?

    A:我们将DNA 或者RNA 片段化后,在进行免疫沉淀前,需要取一部分断裂后的染色质做Input 对照(不进行免疫沉淀过程)。Input 是断裂后的基因组DNA 或者RNA,需要与沉淀后的样品DNA/RNA 一起经过逆转交联,DNA/RNA 纯化,以及最后的PCR 或其他方法检测。通过后续数据分析,我们可以通过Input 对照排除背景噪音(排除因本底表达水平高或一些非特异性结合所造成的假阳性peaks),验证染色质断裂的效果和整个实验的IP 效果,所以Input 对照是IP-seq 实验必不可少的步骤。

5. Q:阳性对照和阴性对照是什么?

    A:阳性对照一般用anti-RNA polymerase II 抗体,因为RNA polymerase II 是通用转录因子,在所有细胞中都能结合基因的核心启动子区,因此理论上,ChIP PCR 会有条带。一般阳性对照不进行测序,阴性对照分为mockInput两种,二者均能起到减少假阳性的作用。mock:用普通IgG为抗体,理论上不会ChIP 下来任何DNA 片段,因此作为阴性对照,但是由于非特异性结合,或者实验过程,没发生结合的DNA 洗涤不完全,可能会出现条带,但是一般条带亮度较弱。IgG 不需要进行测序,只是判断IP 试验中所选取的抗体是否特异。