外显子组&目标区域测序

    外显子组是一个物种基因组中全部外显子区域的总和。人全外显子测序技术,是指利用序列捕获技术将人的全基因组中全部外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。它是一种选择基因组的编码序列进行分析的高效策略。外显子测序相对于基因组重测序成本较低,同时基于大量的公共数据库提供的外显子数据,对研究已知基因的SNPInDel分析等具有较大的优势,能够结合现有的资源更好地解释研究成果。

    目标区域测序是指利用特制的探针对感兴趣的蛋白编码区域DNA或某段特定序列进行富集,随后通过高通量测序技术对该目标区域进行深度测序,发现特定遗传信息,极大提高了基因组中目标区域的研究效率,显著降低了研究成本。该技术可用于鉴定和研究孟德尔疾病,复杂疾病如癌症、糖尿病、肥胖症等的致病基因和易感基因,进行群体研究,如人类罕见遗传变异等,帮助研究人员更好地解释这些疑难杂症的致病机理。


技术路线

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技术参数

产品

策略

测序深度

周期

外显子组测序

Hiseq PE150

平均有效测序深度

100X

35

目标区域测序

Hiseq PE150

平均有效测序深度

200X

定制探针60天

建库测序分析35天

样品要求

1. 基因组DNADNA浓度≥ 20 ng/μl,总量≥ 0.6 μgOD 260/2801.7~1.9之间,无明显RNA、蛋白质等杂质污染,基因组条带清晰、完整。样品浓度越高越好。请用干冰运输样品到实验室(不超过48 h),且事先用封口膜将管口密封好,防止出现污染。

2. 组织样本:必须是在手术切除后立即冷冻保存(液氮或-80℃),保存时间不要超过半年。取肿瘤样本时建议不要带有黄色脂肪组织和血液,重量大于50 mg。请用干冰运输样品到实验室(不超过48 h),且事先用封口膜将管口密封好,防止出现污染。

3. 全血或骨髓样品:体积大于2 mL,需用紫色盖子的抗凝血管取样并保存于-80℃。请用干冰运输样品到实验室(不超过48 h),且事先用封口膜将管口密封好,防止出现污染。

4. 细胞悬液或细胞系:建议细胞数大于105个,按照细胞冻存的标准操作并保存于液氮或-80℃。请用干冰运输样品到实验室(不超过48 h),且事先用封口膜将管口密封好,防止出现污染。

5. 石蜡样品:蜡块或者是石蜡切片,且切片未经过染色等处理,并建议切片上或者蜡块里的组织不能零碎,完整组织最好,切片数大于10片。请用普通条件运输样品到实验室。

6. 样品保存期间切忌反复冻融。

常见问答

1. Q:外显子测序有哪些优势?

A:外显子测序是全基因重测序的一个较为经济的替代手段,对研究基因的SNPIndel等具有较大的优势。与全基因组测序相比,外显子测序覆盖度更深,数据准确性更高,并且利用丰富的公共数据库中的外显子数据,可以更好的理解序列结果,研究成本大大降低。

2. Q:外显子组测序需要多少的覆盖深度?

A:我们推荐采用50×100×的覆盖深度,目标区域测序推荐200×以上测序深度,根据项目的具体需求选择合适的覆盖深度。

3. Q:外显子测序中的捕获效率及覆盖度分别指什么?

A:捕获效率指比对到目标区域的有效数据量占总数据量的比例。捕获效率的高低不影响数据质量,只影响数据的有效比例。覆盖度是目标区域被覆盖到的比率,是研究人员较为关心的指标。

4. Q:癌症基因组学测序为什么通常选取同一个患者成对的癌组织和癌旁组织/血液样本?

A:癌症基因组学侧重于研究肿瘤细胞特有的、非遗传因素导致的体细胞突变,因此我们需要选取患者的正常组织进行测序,以过滤germline mutations。由于考虑到个体间germline突变差异很大,为避免筛选出很多假阳性体细胞突变位点,肿瘤和正常组织需来源于同一个体。

5. QFFPE样本和ctDNA研究适合用外显子测序吗?

A:适合,在进行FFPE样本建库前,我们会先对FFPE样本进行质检,质检合格的样本可以进行测序研究,由于FFPE样本和ctDNA自身的特点,其本身存在DNA片段化、起始量不足等情况,高深度的外显子测序可以通过增加测序reads数,提高变异检出的准确性。